第十九章 免疫學(xué)檢測技術(shù)

　　一、血清學(xué)技術(shù)

　　血清學(xué)反應(yīng)是指在體外進(jìn)行的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，相關(guān)的技術(shù)稱為血清學(xué)技術(shù)。

　　(一)沉淀反應(yīng)

　　可溶性性抗原和相應(yīng)特異性抗體以合適的比例結(jié)合，在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。單向免疫擴(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散、對流免疫電泳、免疫電泳均為沉淀反應(yīng)。

　　1.單向免疫擴(kuò)散 制備含特異性抗體的瓊脂板。在適當(dāng)?shù)奈恢么蚩祝�加相�?yīng)抗原于孔內(nèi)。抗原自小孔向四周瓊脂中擴(kuò)散，在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬森h(huán)狀的沉淀線。環(huán)的直徑和抗原的濃度呈正相關(guān)。此法常用于人或動物血清免疫球蛋白和補(bǔ)體成分的測定。

　　2.雙向免疫擴(kuò)散 在瓊脂板上按一定距離打孔。在相鄰的兩孔中分別加入抗原和抗體。抗原和抗體在瓊脂中擴(kuò)散，當(dāng)二者相對應(yīng)時，可在兩孔間的適當(dāng)位置形成由免疫復(fù)合物組成的沉淀線。此法常被用于抗原或抗體的定性。

　　3.對流免疫電泳 將兩端各打一排孔的瓊脂板置電泳槽中，在陰極一側(cè)的孔中加抗原，陽極一側(cè)孔中加抗體，通電使抗原抗體分子泳動，當(dāng)二者相對應(yīng)時，可于一定時間后在兩排孔之間形成沉淀線。對流電泳是電場作用下的雙向免疫擴(kuò)散。

　　4.免疫電泳 先將待測抗原樣品做瓊脂糖凝膠電泳，使不同的組分依電泳速度不同而分散開。然后在樣品泳道一側(cè)的適當(dāng)距離處挖一和泳道平行的直線溝槽。于槽內(nèi)加入已知抗體(一種或多種)。讓抗原和抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散，在泳道和槽的中間形成沉淀線。此法可用于免疫球蛋白缺乏或增多疾病的診斷和鑒別診斷。

　　(二)凝集反應(yīng)

　　顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞、偶聯(lián)抗原的乳膠顆粒)與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，此稱為凝集反應(yīng)。

　　1.直接凝集 直接凝集是顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞)與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。利用直接凝集可鑒定細(xì)菌和血型。

　　2.間接凝集 將可溶性抗原或抗體包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒載體表面后，與相應(yīng)抗體或抗原作用出現(xiàn)的凝集。采用紅細(xì)胞為載體的間接凝集稱間接血凝。采用乳膠顆粒為載體的凝集稱為乳膠凝集。以包被抗原檢測抗體的間接凝集稱為正向間接凝集。以包被抗體檢測抗原的間接凝集稱為反向間接凝集。

　　用此法可檢測乙型肝炎表面抗原和甲胎蛋白等。

　　二、免疫標(biāo)記技術(shù)

　　(一)免疫熒光

　　免疫熒光技術(shù)是用熒光素標(biāo)記的抗體或(抗原)分子檢測相對應(yīng)的抗原或抗體分子的技術(shù)。

　　1.直接熒光法 把熒光素標(biāo)記的抗體與待檢標(biāo)本(細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片或組織切片)相互作用，洗去未結(jié)合熒光標(biāo)記抗體，在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位為陽性。

　　2.間接熒光法 將特異性抗體(一抗)和待檢標(biāo)本(細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片或組織切片)相互作用后，加入熒光索標(biāo)記的一抗的抗體(二抗)顯示結(jié)果。

　　免疫熒光法在病原體的診斷、細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定等方面用途廣泛。流式細(xì)胞儀(FACS)是用于分離、鑒定熒光素標(biāo)記單克隆抗體識別細(xì)胞的儀器。

　　(二)放射免疫分析

　　根據(jù)競爭結(jié)合原理，應(yīng)用放射性核素標(biāo)記的抗原與相應(yīng)的抗體(抗原)結(jié)合，通過抗原抗體復(fù)合物的放射性活性判斷結(jié)果稱放射免疫分析。該方法最敏感。

　　1.液相法 將待檢標(biāo)本(含抗原)與定量的放射性核素標(biāo)記的已知抗原和定量的特異抗體混合，經(jīng)一定時間的作用后，分別測定免疫復(fù)合物和游離部分的放射性。根據(jù)用非標(biāo)記抗原作成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定待檢樣品中相應(yīng)抗原的含量。

　　2.固定法將吸附到固相載體表面的抗原與待檢標(biāo)本(含抗體)作用，然后加標(biāo)記抗體。測定結(jié)合于固相載體的放射性，判定結(jié)果。

　　放射免疫分析法在激素、藥物、抗體、維生素的測定等方面應(yīng)用廣泛。

　　(三)酶免疫分析

　　1.免疫酶染色 酶標(biāo)抗體和抗原(如組織切片上的抗原)發(fā)生特異性結(jié)合后，加入酶底物。底物在酶的催化下生成有色的物質(zhì)。

　　2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)

　　(1)間接法：將已知的抗原包被在固相載體的表面，加入待檢標(biāo)本(含特異性抗體)，再加入酶標(biāo)記抗Ig抗體(第二抗體)。加底物顯色，根據(jù)顏色的光密度判定標(biāo)本中抗體的含量。

　　(2)夾心法：將已知的特異性抗體包被在固相載體表面，加入待檢標(biāo)本(含抗原)，標(biāo)本中的抗原和包被的抗體結(jié)合。沖洗后，加入該抗原的酶標(biāo)抗體，加底物顯色。根據(jù)顏色的光密度判定標(biāo)本中抗原的含量。

　　3.ELISPOT測定法 用某種細(xì)胞因子的抗體包被固相載體(如96孔板)，加入待檢細(xì)胞，經(jīng)孵育后，如待檢細(xì)胞分泌了細(xì)胞因子，這些因子被包被的抗體捕獲。洗去細(xì)胞，加細(xì)胞因子特異性抗體。洗去未結(jié)合抗體。加酶標(biāo)抗體，洗去未結(jié)合抗體。加底物顯色后，可出現(xiàn)有顏色的斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)的數(shù)量可判定細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的數(shù)量，根據(jù)斑點(diǎn)的深淺，也可判定此細(xì)胞因子的相對含量。

　　(四)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記技術(shù)

　　用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(如魯米諾)標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行抗體或抗原檢測的方法。其結(jié)果用發(fā)光光度計(jì)來檢測。

　　(五)免疫印跡試驗(yàn)

　　將抗原物質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分帶后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用酶標(biāo)或放射性核素標(biāo)記的抗體識別和結(jié)合抗原，加底物顯色或做放射自顯影顯示結(jié)果。該法能測定待檢蛋白質(zhì)的分子量和特異性。應(yīng)用該法檢測血清中的HIV抗體是確認(rèn)HIV感染的方法。