三、淋巴細(xì)胞的分離和檢測技術(shù)

　　(一)外周血單個核細(xì)胞的分離

　　聚糖-泛影葡胺(又稱淋巴細(xì)胞分離液)密度梯度離心法是分離制備外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的常用方法。將抗凝血疊加于分離液上，通過低速離心，即可將不同比重的細(xì)胞分層：紅細(xì)胞沉于管底;中性粒細(xì)胞密集布于紅細(xì)胞層與分離液之間;血小板懸浮于血漿中;PBMC則密集于血漿層與分離液界面。PBMC含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。利用單核細(xì)胞粘附塑料的特性，可將其從PBMC中移去。

　　(二)流式細(xì)胞法

　　流式細(xì)胞法(flow cytometry，F(xiàn)CM)是用熒光活化細(xì)胞分類儀(fluorescence-actirated cell sorter，F(xiàn)ACS)對細(xì)胞進(jìn)行分類的方法。用熒光素標(biāo)記的抗體識別和結(jié)合待分離的細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記熒光素的有無和種類，采用FACS可分離各種免疫細(xì)胞。采用流式細(xì)胞法，也可利用細(xì)胞的表面標(biāo)志對各種免疫細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

　　(三)磁珠分離法

　　磁珠分離法是利用免疫磁珠進(jìn)行分離細(xì)胞的方法。免疫磁珠(immune magnetic bead，IMB)是特異性抗體與磁性微粒的交聯(lián)物。IMB可通過磁珠上的特異性抗體識別并結(jié)合表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞。應(yīng)用磁場，可分離結(jié)合IMB的細(xì)胞。如采用抗CD3特異性抗體IMB可分離T淋巴細(xì)胞。

　　(四)T細(xì)胞的功能測定技術(shù)

　　1.T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 在體外培養(yǎng)的條件下，人T淋巴細(xì)胞受特異性抗原(如結(jié)核菌素)或非特異性有絲分裂原如植物血凝素(PHA)的刺激后可發(fā)生增生，轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。以3H-胸腺嘧啶參入試驗可測定淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的程度。細(xì)胞免疫功能低下的人，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低。刀豆蛋白A(ConA)是小鼠T細(xì)胞的非特異性有絲分裂原。

　　2.混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)器官移植前應(yīng)取受體與供體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗以挑選合適的供體。混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分雙向法和單向法。

　　(1)雙向法：將兩個個體的淋巴細(xì)胞混合在一起培養(yǎng)，若二者的HLA分子不同，兩個來源的淋巴細(xì)胞都會受到刺激而發(fā)生轉(zhuǎn)化。根據(jù)轉(zhuǎn)化的程度可判定兩個個體淋巴細(xì)胞HLA分子的相異的程度。單卵雙生子間的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后不發(fā)生轉(zhuǎn)化。

　　(2)單向法：將一個個體的淋巴細(xì)胞用絲裂霉素或放射處理使之失去自身的轉(zhuǎn)化能力，但保留著抗原性。用這種淋巴細(xì)胞和未經(jīng)處理的另一個個體的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。根據(jù)未經(jīng)處理的淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度來判定兩個個體淋巴細(xì)胞HLA分子的相差的程度。

　　混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞均可發(fā)生轉(zhuǎn)化。

　　3.遲發(fā)超敏反應(yīng)皮試 將已知量的抗原(如結(jié)核菌純化蛋白衍生物)注射入前臂皮內(nèi)，24～48小時后測定硬結(jié)大小，硬結(jié)直徑大于lOmm即被視為陽性。皮試陰性的人，可能有細(xì)胞免疫功能低下也可能未接觸過相應(yīng)的抗原。

　　4.細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗 用效應(yīng)性CTL和51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞相互作用。被殺傷的靶細(xì)胞可釋放51Cr。測定靶細(xì)胞釋放的51Cr產(chǎn)生的放射性，就可判定效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)性CTL的細(xì)胞毒活性。用類似的方法也可測定NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

　　(五)B淋巴細(xì)胞功能的檢測

　　1.B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗將人淋巴細(xì)胞和不溶性的金黃葡萄球菌(B淋巴細(xì)胞分裂原)一起培養(yǎng)，以3H-胸腺嘧啶參入試驗可測定發(fā)生B淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的程度。細(xì)菌脂多糖是小鼠的B細(xì)胞分裂原。

　　2.抗體生成細(xì)胞的測定 常用溶血空斑試驗(hemolytic plaque assay)。在此實驗中，抗體生成細(xì)胞分泌的Ig與綿羊紅細(xì)胞(SRBC)表面的抗原結(jié)合，在補體參與下出現(xiàn)溶血反應(yīng)。方法是將吸附有已知抗原的SRBC、待檢的B細(xì)胞、補體及適量瓊脂糖液混合，傾注平皿，溫育l～3小時后，肉眼可見分散的溶血空斑，每一空斑中央含一個抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。

　　四、細(xì)胞因子的檢測技術(shù)

　　(一)生物活性檢測

　　多種細(xì)胞因子(如IL-2、IL-6)在體外試驗中可刺激其依賴株細(xì)胞增生。以3H-胸腺嘧啶核苷參入法做細(xì)胞增生試驗就可判定這些細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。

　　利用某些細(xì)胞因子的功能特點也可檢測其生物學(xué)活性。例如，利用干擾素可保護(hù)L929細(xì)胞免受水泡性口炎病毒的破壞的性質(zhì)可檢測干擾素的生物學(xué)活性。利用TNF殺傷L929細(xì)胞的特點檢測TNF的生物學(xué)活性。

　　(二) ELISA檢測

　　采用ELISA法,用細(xì)胞因子的特異性抗體可對各種細(xì)胞因子進(jìn)行定量測定。

　　(三)DNA聚合酶鏈反應(yīng)

　　采用反轉(zhuǎn)錄(RT)DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )的方法，即RT-PCR方法可測定待檢細(xì)胞中細(xì)胞因子特異性mRNA 的表達(dá)。該法易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果.為了克服此缺點，在實驗中必須設(shè)嚴(yán)格的對照。

　　例題：

　　1、外周免疫器官不包括( )

　　A、胸腺 B、淋巴結(jié) C、脾臟 D、粘膜相關(guān)淋巴組織

　　2、人B細(xì)胞分化成熟的部位是在( )

　　A、胸腺 B、脾臟 C、骨髓 D、法氏囊

　　3、木瓜蛋白酶水解IgG所獲片段中，能與抗原特異結(jié)合的是( )

　　A、Fab段 B、Fc段 C、F(ab)2 段 D、pFc段

　　參考答案

　　1、A 2、C 3、A