四、論述題

　　1、試述生物樣品內(nèi)藥物分析的對(duì)象與特點(diǎn)。

　　(1).生物樣品內(nèi)藥物分析的對(duì)象

　　凡是生物樣品內(nèi)藥物到達(dá)之處，如體液、器官、組織、排泄物等都是分析的對(duì)象，所以生物樣品內(nèi)藥物分析的樣本有血液、尿液、唾液、膽汁、淋巴液、淚液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、糞便、各種器官、組織以及呼出的氣體。

　　生物樣品內(nèi)藥物分析的目標(biāo)，不僅是母體藥物也包括代謝產(chǎn)物，因?yàn)榇�謝產(chǎn)物常具有生理活性，弄清它們的種類、結(jié)構(gòu)、數(shù)量及分布情況，可了解藥物在生物樣品內(nèi)的變化及消除規(guī)律，這對(duì)安全用藥和正確評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量也是非常重要的。

　　由于新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，或者對(duì)老藥在某一方面的重新評(píng)價(jià)，一般要求先在動(dòng)物身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以生物樣品內(nèi)藥物分析對(duì)象不僅是人體，也包括動(dòng)物體。

　　(2).生物樣品內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)

　　與常規(guī)藥物分析相比，生物樣品內(nèi)藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。在生物樣品內(nèi)藥物分析中，微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中，樣品中含內(nèi)源性干擾雜質(zhì)，這些干擾物質(zhì)又隨疾病情況而有所不同。很多藥物在生物樣品內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝可產(chǎn)生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結(jié)合，這一切給藥物分離、分析帶來(lái)困難，這就要求分析方法具有更高的選擇性。另外，在生物樣品中，藥物濃度都很低，一般血藥濃度在10-6g/mL～10-9g/mL之間，且生物樣品若為血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法有較高的靈敏度。

　　生物樣品內(nèi)藥物分析具有干擾雜質(zhì)多、樣品量少、要求較快提供結(jié)果等特點(diǎn)。

　　2、試述生物樣品預(yù)處理的必要性。

　　根據(jù)生物樣品內(nèi)藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)以及藥物在生物樣品內(nèi)的存在形式、生物轉(zhuǎn)化狀況，欲進(jìn)行體內(nèi)藥物及其代謝物測(cè)定，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后進(jìn)行直接測(cè)定外，一般在測(cè)定之前需采取適當(dāng)?shù)臉悠奉A(yù)處理，即進(jìn)行分離、凈化、濃集、衍生化等，從而為藥物的分析測(cè)定創(chuàng)造良好的條件。

　　藥物在體內(nèi)以多種形式存在，有原型藥(游離型)，有與生物分子形成的結(jié)合物(與蛋白結(jié)合型)，有代謝物，有綴合物(與葡萄糖醛酸、硫酸形成的苷、酯等)，需分別測(cè)定;待測(cè)物濃度很低，而生物樣品的介質(zhì)組分繁雜，有眾多內(nèi)源性成分(蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、色素、類脂等)和各種潛在的干擾物存在，還有一些共存藥物以及各種外源性物質(zhì)也會(huì)影響測(cè)定;待測(cè)藥物類型眾多，性質(zhì)各異很難對(duì)樣品規(guī)定固定的程序和方式，所以樣品處理必須根據(jù)藥物類型、理化性質(zhì)、存在形式、濃度范圍、測(cè)定目的、選取的生物樣本類型及最后一步測(cè)定方法等多種因素，采取相應(yīng)的分離步驟和凈化技術(shù)。

　　3、試述預(yù)處理生物樣品時(shí)待測(cè)物的損失與玷污。

　　在樣品預(yù)處理過(guò)程中待測(cè)物的損失，是由容器的吸附、蛋白共沉淀、藥物不穩(wěn)定而產(chǎn)生化學(xué)降解或與重金屬離子配合、衍生化反應(yīng)不完全、濃縮過(guò)程中揮發(fā)等因素所致。樣品的玷污問題，是由于生物樣品內(nèi)藥物測(cè)定具有在復(fù)雜體系中測(cè)定痕量物質(zhì)的特點(diǎn)，內(nèi)源性和外源性污染將引起測(cè)量結(jié)果不可靠，誤差變大。在通常實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，所用器皿、材料(塑料、潤(rùn)滑油、濾紙、蒸餾水純度等)、提取溶劑和衍生化試劑中夾雜的雜質(zhì)、血樣中脂肪酸及其酯類、人體的皮膚、手指接觸容器所帶入的雜質(zhì)等都有可能玷污樣品。以上這些問題嚴(yán)重時(shí)，會(huì)使整個(gè)測(cè)定毫無(wú)意義，甚至引起錯(cuò)誤判斷。

　　4、試述生物樣品分析方法的設(shè)定依據(jù)。

　　(1)在做好文獻(xiàn)總結(jié)及整理工作的基礎(chǔ)上充分了解待測(cè)藥物的特性與生物樣品內(nèi)狀況。藥物的理化性質(zhì)包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，生物樣品內(nèi)藥物分析的對(duì)象是來(lái)自生物體內(nèi)的樣品，因此對(duì)藥物在生物樣品內(nèi)的狀況必須了解，如藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、生物樣品內(nèi)代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔、分析方法的選擇等。

　　(2)明確測(cè)定的目的和要求。應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)。前者要求具有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，不強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)便、快速，設(shè)計(jì)方法時(shí)應(yīng)考慮到不同時(shí)間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)，則要求方法簡(jiǎn)便、快速。另外，是否要求同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物，若需同時(shí)測(cè)定兩者，則應(yīng)選擇具有分離能力或?qū)�屬的測(cè)定方法。同時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，選擇可行的方法。

　　5、試述生物樣品分析方法建立的一般步驟。

　　(1)以純品進(jìn)行測(cè)定

　　取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測(cè)定，求得濃度與測(cè)定響應(yīng)值之間的關(guān)系，進(jìn)行線性范圍、最適測(cè)定濃度、檢測(cè)靈敏度、測(cè)定最適條件(如pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等)等的選擇。

　　(2)空白樣品測(cè)定

　　取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定空白值(或色譜圖)�？瞻字蹈叩突蛏�譜圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性，應(yīng)力求將空白值降低。在色譜分析中應(yīng)力求減少樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對(duì)無(wú)法消除的內(nèi)源性雜質(zhì)峰應(yīng)設(shè)法使其從待測(cè)物的色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好的樣品空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是決定測(cè)定方法實(shí)際可行性的重要環(huán)節(jié)，必須設(shè)法解決。

　　(3)以水代替空白樣品，添加對(duì)照品后測(cè)定

　　.以水代替空白生物樣品，添加一定量對(duì)照品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，以了解提取回收率及最低檢測(cè)濃度的大致情況，從而對(duì)提取溶劑、富集方法等條件進(jìn)行選擇。

　　(4)空白樣品中添加對(duì)照品后測(cè)定

　　于空白生物樣品中，添加一定量對(duì)照品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若采用色譜法測(cè)定，若需要用內(nèi)標(biāo)法定量，則應(yīng)首先選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行回收率的測(cè)定。

　　(5)生物樣品內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定

　　6、生物樣品分析方法的評(píng)價(jià)內(nèi)容有哪些?

　　評(píng)價(jià)一個(gè)生物樣品內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣主要有以下幾個(gè)指標(biāo)：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測(cè)濃度范圍、測(cè)定所需時(shí)間以及對(duì)生物樣品的適應(yīng)性等。

　　準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)之一。將已知量的藥物純品加到空白樣品(如血樣)中經(jīng)過(guò)一系列的處理、測(cè)定，所得藥物量與加入量之比值的百分率即為回收率。根據(jù)回收率測(cè)定方法不同可分為絕對(duì)回收率和方法回收率。

　　(1)絕對(duì)回收率又稱萃取回收率、提取回收率，它反映了一個(gè)方法的萃取效率，與生物樣品內(nèi)樣品檢測(cè)靈敏度有關(guān)，是評(píng)價(jià)生物樣品內(nèi)藥物分析方法的重要指標(biāo)之一。

　　(2)方法回收率是取一系列濃度的藥物對(duì)照品加到空白體液中，按設(shè)定方法測(cè)定，根據(jù)對(duì)照品濃度及響應(yīng)信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取高、中、低濃度的藥物對(duì)照品添加到空白體液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測(cè)定，求得測(cè)定值。最后與加入量比較，得方法回收率。

　　精密度 精密度是表示一組測(cè)量值彼此符合的程度。精密度測(cè)定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測(cè)定。低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度，精密度可進(jìn)一步分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度。前者表示一次測(cè)定的重復(fù)性，后者表示不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。

　　靈敏度 靈敏度是指一種方法可以檢測(cè)出有關(guān)化合物的最小量。

　　檢測(cè)限表示在生物介質(zhì)中藥物的最低可測(cè)度(或絕對(duì)量)。通常以被測(cè)信號(hào)和背景噪音比S/N為2～3倍時(shí)的被測(cè)物的絕對(duì)量來(lái)表示。

　　定量限是指生物介質(zhì)中藥物可定量測(cè)定的最低量，表示方式和測(cè)定方法與檢測(cè)限相同，它與檢測(cè)限的不同在于定量限規(guī)定的最低測(cè)得濃度應(yīng)該符合一定精密度和準(zhǔn)確度的要求。

　　最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)，

　　方法的專屬性 方法的專屬性，也稱選擇性，是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時(shí)，該法定量測(cè)定被測(cè)物的能力。即測(cè)定的信號(hào)應(yīng)是屬于被測(cè)物所特有的，否則就易受干擾。考察一個(gè)方法是否專屬，應(yīng)著重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時(shí)服用藥物的干擾。

　　線性范圍 線性范圍通常是將藥物對(duì)照品加入空白體液中，制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按規(guī)定方法處理、測(cè)定。根據(jù)藥物對(duì)照品濃度和響應(yīng)信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或計(jì)算回歸方程，求出r值和濃度范圍。

　　穩(wěn)定性 藥物的穩(wěn)定性是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在特定的容器和生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。在生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性包括長(zhǎng)期貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過(guò)程的穩(wěn)定性，也包括標(biāo)準(zhǔn)貯備液中待測(cè)物的穩(wěn)定性。

　　7、試述生物樣品分析方法的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)內(nèi)容。

　　藥物的穩(wěn)定性是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在特定的容器和生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。在生物樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性包括長(zhǎng)期貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過(guò)程的穩(wěn)定性，也包括標(biāo)準(zhǔn)貯備液中待測(cè)物的穩(wěn)定性。

　　(1)長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性

　　長(zhǎng)期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過(guò)收集第一個(gè)樣品至最后一個(gè)樣品分析所需用的時(shí)間周期。貯存溫度一般為-20℃，如果需要也可在-70℃貯存。要求高、低濃度至少分別測(cè)定3次，與第一天測(cè)得的相應(yīng)濃度的結(jié)果進(jìn)行比較。

　　(2)短期室溫穩(wěn)定性

　　高、低濃度各3份于室溫下放置4～24小時(shí)(根據(jù)實(shí)際操作在室溫中需維持的時(shí)間而定)，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行分析，與0小時(shí)測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較。

　　(3)冷凍-解凍穩(wěn)定性

　　取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯存24小時(shí)，取出置室溫放置使自然融解。當(dāng)融解完全后，取樣，進(jìn)行分析。然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持12～24小時(shí)，如此解凍-冷凍應(yīng)重復(fù)循環(huán)二次以上，然后比較各次分析結(jié)果。

　　(4)貯備液穩(wěn)定性

　　藥物與內(nèi)標(biāo)物貯備溶液的穩(wěn)定性應(yīng)對(duì)其在室溫下至少6小時(shí)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，然后將其冷藏或冷凍7～14天或恰當(dāng)周期后進(jìn)行測(cè)定，所得儀器響應(yīng)值與新鮮配制溶液所得響應(yīng)值進(jìn)行比較。

　　8、試述生物樣品分析的常用測(cè)定方法有哪些。

　　(1)光譜法

　　采用具有選擇性的顯色劑和反應(yīng)條件，才可以不經(jīng)分離提取，直接用比色法測(cè)定生物樣品中的藥物含量。比色法靈敏度不高，通常只能測(cè)定出1µg/mL濃度以上的樣品。但該法快速、簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備要求不高。

　　熒光法具有較高的靈敏度，專屬性也較強(qiáng)，但藥物必須具有一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)才能產(chǎn)生熒光。藥物中具有天然熒光者不多，通常需采用適當(dāng)處理，常用化學(xué)引導(dǎo)熒光法，如紫外輻射氧化、水解或強(qiáng)酸脫水等，或用適當(dāng)?shù)臒晒庠噭┡c藥物起偶合或縮合反應(yīng)，產(chǎn)生熒光發(fā)生團(tuán)。

　　(2)色譜法

　　經(jīng)典的薄層色譜定量法，操作比較繁瑣，準(zhǔn)確性較差。不適用于體液中藥物成分濃度的測(cè)定。高效薄層色譜法靈敏度較高，常用于生物樣品中成分的測(cè)定，與氣相色譜法、高效液相色譜法相比，也有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，

　　高效液相色譜法在生物樣品內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用已大大超過(guò)了其他分析方法。具有適用范圍廣，可在室溫下進(jìn)行;樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單;分離效率高，流動(dòng)相選擇范圍廣;可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測(cè)定極性大的水溶性藥物;檢測(cè)方法多是非破壞性的，流出組分可回收;專一性較高等優(yōu)點(diǎn)。

　　氣相色譜法只要選擇適當(dāng)?shù)纳�譜條件，母體藥物、代謝物及其可能同時(shí)服用的其他結(jié)構(gòu)相類似的藥物都能得到很好分離，常作為建立其他生物樣品內(nèi)藥物分析方法的參比方法。

　　高效毛細(xì)管電泳法有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜法的高效率等優(yōu)點(diǎn)，其選擇性與高效液相色譜有很大的互補(bǔ)性。廣泛應(yīng)用于生物大分子，體內(nèi)藥物及代謝物，手性藥物，中、西藥物及其制劑等的分析。

　　(3)聯(lián)用技術(shù)

　　聯(lián)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與分析，成為分析技術(shù)中最重要的檢測(cè)手段，尤其適合于對(duì)熱不穩(wěn)定的、揮發(fā)性差的或極性大的成分分析，高分辨的液相色譜與高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用分析，特別適用于復(fù)雜生物樣品中藥物及其代謝物的研究。

　　(4)免疫分析法

　　免疫分析中按標(biāo)記物的不同，可分為放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光免疫分析等。根據(jù)抗原-抗體的反應(yīng)達(dá)平衡后是否需將結(jié)合物(B)與游離標(biāo)記物(F)分離，免疫分析可分為均相免疫分析和非均相免疫分析兩大類。

　　各種免疫分析的基本原理是一樣的，即競(jìng)爭(zhēng)抑制原理。人工抗原的制備和特異抗體的制備也相同，只是標(biāo)記抗原(標(biāo)記藥物)的標(biāo)記物不同，由此產(chǎn)生的測(cè)定方法也不同。

　　9、試述生物樣品分析中免疫分析法的分類及內(nèi)容。

　　免疫分析中按標(biāo)記物的不同，可分為放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光免疫分析等。根據(jù)抗原-抗體的反應(yīng)達(dá)平衡后是否需將結(jié)合物(B)與游離標(biāo)記物(F)分離，免疫分析可分為均相免疫分析和非均相免疫分析兩大類。

　　各種免疫分析的基本原理是一樣的，即競(jìng)爭(zhēng)抑制原理。人工抗原的制備和特異抗體的制備也相同，只是標(biāo)記抗原(標(biāo)記藥物)的標(biāo)記物不同，由此產(chǎn)生的測(cè)定方法也不同。

　　放射免疫分析是20世紀(jì)50年代末開始發(fā)展起來(lái)的一種超微量分析技術(shù)，它是利用放射性同位素的測(cè)量方法與免疫反應(yīng)基本原理相結(jié)合的一種同位素體外檢測(cè)法。本法最早應(yīng)用于血漿中微量胰島素的分析，這一方法不僅用于測(cè)定大分子量、有抗原性的蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)，而且也廣泛用于測(cè)定許多小分子量、本身無(wú)抗原性的藥物和代謝物等，許多RIA藥盒已商品化。

　　酶免疫分析是20世紀(jì)70年代在RIA基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫分析方法。將抗原抗體特異反應(yīng)與酶的高效專一催化特性相結(jié)合，用酶代替放射性同位素來(lái)標(biāo)記藥物，具有無(wú)放射性危害，標(biāo)記物衰退期長(zhǎng)和儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，隨著研究進(jìn)展，EIA的靈敏度已達(dá)到甚至超過(guò)RIA，凡RIA能測(cè)試的項(xiàng)目幾乎均可用EIA來(lái)替代。

　　標(biāo)記酶的作用也是提供可測(cè)信號(hào)，但酶本身并不能直接發(fā)出信號(hào)，必須要有其他物質(zhì)如酶底物、輔酶等的參與才能完成酶反應(yīng)，引起吸收光譜等方面的變化以供檢測(cè)。

　　按照測(cè)定過(guò)程中，抗原-抗體反應(yīng)是在單一液相中進(jìn)行還是在液固相中進(jìn)行，可將EIA分為均相酶免疫分析法和非均相酶免疫分析法。

　　一些化學(xué)物質(zhì)在氧化時(shí)會(huì)發(fā)出光量子，這種氧化反應(yīng)稱化學(xué)發(fā)光，具有這種性質(zhì)的分子稱化學(xué)發(fā)光分子，用它標(biāo)記抗原或抗體，以達(dá)到測(cè)定抗體或抗原為目的的標(biāo)記免疫技術(shù)，稱化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法。自1976年Schroeder等首先建立了生物素CLIA后，激素等眾多物質(zhì)的CLIA也相繼建立，并在不斷發(fā)展中。CLIA也有均相與非均相兩種類型。

　　熒光免疫分析是以熒光物質(zhì)或潛在熒光物質(zhì)為標(biāo)記物，當(dāng)標(biāo)記的藥物與特異抗體相結(jié)合時(shí)，發(fā)生熒光強(qiáng)度的改變，或在相應(yīng)的酶作用下發(fā)生熒光來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中藥物濃度的一種方法。也可分為均相與非均相兩類，均相熒光免疫分析能自動(dòng)化操作，是目前應(yīng)用比較廣泛的免疫分析法。按標(biāo)記物產(chǎn)生熒光方式不同，可將熒光免疫分析分為底物標(biāo)記熒光免疫分析、熒光偏振免疫分析、熒光淬滅和熒光增強(qiáng)免疫分析等。